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如何利用单光子计数相机轻松搞定FLIM/FRET

更新时间:2023-02-21 点击量:552

对于高精度多光子FLIM,时间相关单光子计数(TCSPC)在测量精度方面非常优秀。就成像速度而言,由于发射过程的随机性,要求检测率远小于每个激发事件一个光子,以防止寿命拟合中的不确定性,导致TCSPC在光子计数率方面受到了极大的限制,于是,激光扫描FLIM的采集时间大约需要几分钟才能完成,然而在这个时间尺度上,许多动态生物事件已经发生并结束。

为了克服该限制,可以采用激光束阵列激发,并配合光电倍增管阵列或时间门控相机检测系统来进行并行信号采集实现。迄今为止,由于多阳极PMT中的串扰,亦或是由于相机系统中的测量方法导致的系统误差,大大的限制了并行采集大量通道荧光寿命数据的准确性。当然,对于单光束扫描系统而言,能通过多阳极PMT中的并行检测来消除计数率限制,从而达到增加帧速率的目的,但与此同时,脉冲堆积效应导致观察到的荧光寿命中的计数率依赖性误差比较严重。此外,各大应用中常见的在轴向和横向都具有较低分辨率的体内成像技术,在没有饱和激发、显著光毒性和光漂白的情况下,高NA物镜是不可能实现。因此,以高时间分辨率定量测量复杂生物事件的能力仍然是一个重大挑战。

然而,开发用于显微镜和光谱技术的SPAD阵列+TDC 单光子计数相机对于高时间分辨率定量测量复杂生物事件是至关重要的。这里使用的32×32 SPAD阵列相机,其中每个像素包含单独的定时电路。在新型多焦点、多光子FLIM显微镜(MM-FLIM)中,通过并行激发和检测过程,显著提高了高分辨率荧光寿命成像的采集速率。该系统的激发部分为二维超快光束阵列(通过SLM全息生成),该光束共轭并精确对准SPAD阵列+TDC 单光子计数相机。将收集的荧光小束直接重新成像到SPAD的光敏感区域上,填充因子光学放大到100%。每个SPAD在TCSPC模式下运行时,显微镜系统有效地由64个单独的多光子FLIM显微镜组成,这些显微镜并行工作从而实现高数据采集速率。

PF32 SPAD阵列+TDC 单光子计数相机是武汉东隆科技有限公司中国区总代理,它是一款32*32面阵SPAD探测器,区别于一般的SPAD面阵探测器,PF32 SPAD阵列+TDC 单光子计数相机的1024个单光子敏感SPAD像素阵列,都具有超快的55ps 时间分辨率TDC 电子元件,从而形成了一个并行的,功能强大,高度紧凑的系统。这种并行性让生命科学、量子成像、激光雷达抑或是单光子成像领域的科研工作者,更加方便、简单的获取和验证实验结果。

参考文献:

S. Poland et al., “A high speed multifocal multiphoton fluorescence lifetime imaging microscope for live-cell FRET imaging "

Biomedical Optics Express Vol. 6, Issue 2, pp. 277-296 (2015)